FIJACIÓN DE CÉLULAS.
La fijación de las células a los cubreobjetos es un paso muy importante para poder realizar tinciones sin perder las células, y conservar bien sus estructuras para poder observarlas.
Hay muchos tipos de fijación, algunos solo fijan, otros fijan y deshidratan, y otros también permeabilizan, debemos elegir el método de fijación dependiendo de lo que queramos realizar posteriormente con las células, ya que por ejemplo para teñir con anticuerpos intracelulares, habrá que permeabilizar las membranas, mientas que si son anticuerpos de membrana solo con fijarlas tendremos suficiente.
FIJACIÓN DE CÉLULAS CON METANOL FRIO Y FORMALDEHÍDO.
El metanol deshidrata las células y las fija permeabilizando su membrana. Esto varias veces destruye la localización de proteínas solubles, pero normalmente se usa para fijar las estructuras principales. Se añade a las células el metanol frío (-20ºC) y las incubamos a -20ºC durante 10 minutos.
Esta fijación es más agresiva y afecta a la fluorescencia de las proteínas GFPs.
Una alternativa es la fijación con paraformaldehído al 3,7% durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego después permeabilizar las células con 0.2% Triton X-100 durante 5 minutos a temperatura ambiente. Este método conserva la distribución de las proteínas. Sin embargo, para determinados anticuerpos como la caveolina 1, los epítopos no quedan expuestos con el paraformaldehido y se necesita la fijación por metanol.
El formaldehido se debe conservar en frio, a 4ºC, hemos comprobado que si la temperatura ambiente es muy alta, las células con formaldehido se fijan peor que si la temperatura ambiente es baja.
OTROS MÉTODOS DE FIJACIÓN:
Paraformaldehyde (PFA)
1. Disolver paraformaldehido al 4% (= 10% formalina) en agua destilada precalentada a 55-60 ºC.
2. Añadir unas gotas de NaOH 1M y agitar hasta disolver totalmente.
3. Enfriar hasta temperatura ambiente (RT). Añadir PBS hasta 1X y llevar el pH a 7.4.
4. Utilizar esta solución fresca, con no más de 1 semana a RT.
Uso:
1. Lavar los cubres con PBS y fijar 20-30' con PFA 4% añadiéndolo lentamente.
2. Lavar los cubres con PBS (3x5').
3. Guardar los cubres fijados a 4ºC en PBS con 0.01 % Azida o comenzar la inmunofluorescencia.
Paraformaldehyde - Acetona
1. Lavar los cubres con PBS a 37ºC.
2. Fijar las células con PFA 4% en PBS durante 10' a RT.
3. Lavar las células con PBS (3x5').
4. Permeabilizar las células con acetona a -20ºC durante 10'. Desarrollar la incubación a -20ºC.
5. A continuación: a) Secar los cubres y guardarlos a 4ºC o b) rehidratarlos con PBS durante 10' a RT y comenzar la inmunofluorescencia.
Uso:
1. Lavar los cubres con PBS.
2. Fijar las células con Histochoice (Sigma, Cole-Parmer) durante 5'-15' a RT.
3. Lavar las células con PBS (3x5').
4. Alternativamente: tratar las células con 0.2-1% Tritón X-100 en PBS durante 10' a RT.
5. Lavar con PBS (3x5') y comenzar la inmunofluorescencia.
Metanol
1. Lavar los cubres con PBS.
2. Añadir Metanol a -20ºC muy lentamente sobre las células e incubar a -20ºC durante 15'.
3. Retirar el Metanol, rehidratar lavando con PBS (2x5') y comenzar la inmunofluores-
cencia a partir del paso 4.
Metanol - Acetona, 80:20
1. Lavar los cubres con PBS.
2. Añadir Metanol:Acetona a -20ºC muy lentamente sobre las células e incubar a -20ºC durante 15'.
3. Retirar el Metanol, rehidratar lavando con PBS (2x5') y comenzar la inmunofluores- cencia a partir del paso 4.
Metanol - Ac. Acético glacial
1. Añadir a los cubres un volumen de metanol/acético (3:1) con un volumen de medio de cultivo. Incubar durante 5' a RT.
2. Lavar los cubres en solución fresca de metanol/acético (3:1) y fijar las células con una incubación de 10' en dicha solución.
3. Lavar con agua destilada (2x5') y a continuación con PBS (3x5'). Comenzar la
inmunofluorescencia a partir del paso 4.
