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GELES DE AGAROSA.
1. Introducción
2. Metodología
3. Resultados y discusiones
Introducción
Este proceso se basa en la migración de las moléculas con carga neta de una muestra, cuando es sometida a un campo eléctrico, hacia el polo opuesto de su carga.
El método no es tan sencillo: primero hay que saber con qué tipo de moléculas estamos trabajando y de acuerdo a esto se elige el procedimiento y los materiales necesarios.
Hay dos fuerzas que determinan la velocidad con que una molécula migrará:
1º-la fuerza eléctrica
2º-la de rozamiento.
La primera es la responsable de que la molécula en cuestión sea atraída hacia uno de los electrodos. Por esto es que cuanto mayor sea el cociente carga/masa de la molécula mayor será la aceleración con que se mueva.
La fuerza de rozamiento tiene una acción opuesta: a mayor rozamiento, menor velocidad de migración. Esta fuerza tiene que ver con el tamaño y forma de la molécula que migra, y con las características del medio en que se mueve.
Vamos a realizar una electroforesis para separar moléculas de DNA doble cadena.
La carga neta de estas moléculas está dada por los grupos fosfatos: como hay un fosfato cargado negativamente por cada nucleótido y la masa de los cuatro desoxirribonucléotidos es similar, podemos afirmar que el cociente carga/masa será independiente de la secuencia y la longitud de la doble cadena de DNA (todas las moléculas de DNA migrarán entonces
hacia el ánodo). Esto quiere decir que no nos tendremos que preocupar por la fuerza eléctrica, ya que las diferencias en la migración estarán dadas exclusivamente por la fuerza de rozamiento. Como las moléculas migran en el mismo medio y todas tienen la misma forma, la velocidad de migración tendrá que ver únicamente con el tamaño de las moléculas
(la longitud de la doble cadena, medida en pares de bases).
Cuando se corren plásmidos, por ejemplo, no podemos afirmar lo mismo: al tener distintas formas no ocurrirá lo explicado anteriormente. Lo mismo pasaría con RNA o DNA simple cadena que formen apareamientos internos: en esos casos hay que desnaturalizar antes de correr, de modo que resulten cadenas lineales.
Para realizar la electroforesis se utiliza un medio de migración adecuado, de modo que la separación sea eficiente, ya que se necesita que exista una suficiente fuerza de rozamiento para que las moléculas de distinto tamaño se separen. Para ello se utiliza un gel que consiste en una red compuesta por un polímero orgánico (en este caso usamos agarosa, derivado de un polisacárido de un alga) y que aumenta considerablemente la fricción,
impidiendo a la vez la difusión de las moléculas a través del medio acuoso en todas las direcciones.
Al colocar las muestras de DNA a través de este gel y someterlo a un campo eléctrico durante cierto tiempo, podemos verlas separadas según su tamaño. La rapidez con que migren las moléculas puede ser regulada por la concentración de agarosa disuelta en buffer que usemos: a mayor concentración, mayor compactación de la red y por tanto menor velocidad de migración. La concentración que elijamos dependerá de lo que se quiera
separar en cada corrida.
Una vez separados los DNAs de distintos tamaños, es posible conocer el peso de cada uno ya que el logaritmo del peso molecular es inversamente proporcional a la distancia recorrida desde el lugar de siembra. Es por eso que en cada corrida se hace necesario correr además de las muestras una mezcla de DNAs de pesos conocidos para trazar un gráfico de proporcionalidad. Estas mezclas se consiguen comercialmente y son conocidas como markers.
Metodología:
Preparación del gel:
El gel de agarosa se prepara de la siguiente forma:
Se realiza una solución de agarosa 0,8% p/v en tubo erlenmeyer, disolviéndola en buffer
TAE 1x (1gr de agarosa + 125 ml de buffer).
El buffer garantiza que durante la corrida el pH se mantenga cercano a 8. Esto es importante ya que la migración del DNA depende de las cargas negativas de los fosfatos, y las cargas dependen del pH del medio (es decir, de los iones cargados del medio). Si el pH del medio fuera muy ácido, posiblemente los fosfatos no se encontrarían ionizados y se afectaría la fuerza eléctrica que posibilita la migración de las moléculas.
El buffer TAE 1x se obtiene de una solución stock TAE 50x, que se preparó con 242 g de Tris base, 57,1 ml de ácido acético glacial, 100 ml de EDTA 0,5 M y H2O hasta llegar a 1 litro.
Para disolver esta solución de agarosa en buffer se necesitó calentar en un horno microondas (para fundir).
Luego se agregó el bromuro de etidio, que al intercalarse en el DNA, distorsiona la doble hélice y nos permite visualizar las bandas de DNA una vez finalizada la corrida, en un transiluminador ultravioleta. Como el bromuro de etidio es mutagénico al manipular el gel se debe tener guantes, ya que podría provocar errores en la duplicación de nuestras células.
Al fundirse la solución se la vuelca en el molde con el peine colocado, eliminando toda burbuja presente, y se espera hasta que el gel solidifique completamente antes de ser usado (la agarosa al enfriarse forma interacciones entre las moléculas que al solidificarse forma una red). Luego se retira el peine y se saca la cinta de los bordes que deben estar en
contacto con el buffer.
Se coloca el gel en la cuba de electroforesis, y luego se le agrega suficiente cantidad de TAE 1x para cubrir todo el gel.
Preparación de la muestra:
Vamos a utilizar DNA plasmídico, resuspendido en agua MilliQ, del cual se extrajeron con una micropipeta automática -(p20)- 7 ml y se los agregó a un tubo eppendorf con 2 ml de Loading Buffer (azul bromofenol 0,1%, glicerol 15%), mezclándolos cargando y descargando con la micropipeta.
El azul de bromofenol es un colorante que permite ver la corrida (corre como si fuera tuviera 500 pb de peso, es decir, está en el frente de la corrida), durante la electroforesis, controlando que la muestra no se caiga del gel o no se dirija a otro pocillo. El glicerol es una sustancia viscosa que le provee mayor densidad a la muestra que se sembrará, evitando que difunda a través del buffer en que está inmerso el gel (o sea, que quede en el pocillo donde se siembra y se mantenga contenido en la calle). El Loading Buffer también contenía un colorante, xylen cyanol, que corre en la misma posición que lo haría una molécula de DNA de 3000 pb. Al tubo eppendorf conteniendo el plásmido y el buffer de siembra se le dio un spin (centrifugación de corto tiempo), para que la fuerza centrífuga lleve la solución al fondo del tubo y no queden gotas en la pared de éste.
Se carga la pipeta con toda la muestra del tubo (evitando cargar burbujas de aire) y se la apoya en uno de los bordes del pocillo del gel de agarosa, descargando su contenido en el pocillo (llegando sólo hasta el primer tope, nunca hasta el segundo para evitar la formación de burbujas).
Además de los plásmidos preparados por los grupos (algunos pretratados con RNasa y otros no), se sembraron marcadores de peso molecular conocido (markers), plásmidos pCR previamente digeridos con una enzima de restricción (BamHI), con dos(Bam HI y EcoRI,) o sin digerir, y el plásmido pYES (sin digerir).
Se conecta la cubeta que contiene el gel a un electrodo, con el polo positivo en el lado opuesto al sitio de siembra. El buffer en que está inmerso el gel posibilita además que circule corriente eléctrica, ya que presenta iones (el agua destilada no conduce electricidad, por eso no se puede utilizar como medio de corrida). Se corrió a voltaje constante (3-5 V/cm) hasta que el azul de bromofenol haya migrado aproximadamente 10 cm.
Luego, se apaga la fuente y se expone el gel a radiación ultavioleta (colocado en un transiluminador ultravioleta). Entonces se le toma una fotografía al gel para analizar y discutir los resultados luego.
Resultados y discusiones:
Si se daña mecánicamente al DNA plasmídico cuando se pipetea la solución o al agitarla, se pueden cortar una o las dos cadenas del plásmido, por lo que se verán cambios en el patrón de la corrida: en vez de verse una sola banda (la correspondiente a los círculos covalentemente cerrados, o sea, las moléculas superenrolladas), se podrán ver dos bandas más, en el caso de que se corten algunas moléculas en una sola cadena y otras en las dos cadenas, o sólo una banda más si los plásmidos se cortan de una sola de las dos formas posibles. Vale aclarar que también puede haber formas intermedias, de acuerdo a esta diferente relajación de los plásmidos (es decir, de acuerdo a la cantidad de nicks), pero posiblemente sólo podamos detectar tres como máximo ya que las formas intermedias estarán presentes en poca cantidad.
Las moléculas que más migran hacia el polo positivo son la superenrolladas, ya que pueden atravesar más fácilmente la red de agarosa (al ser más compactas) porque siempre chocan con ésta de igual forma. La banda intermedia que se revela al exponer el gel a luz UV corresponde generalmente a las moléculas lineales (ambas cadenas presentan nick) ya que en solución éstas rotan todo el tiempo y dependiendo de cómo atraviesan el gel se va a dar la migración. Por último, las moléculas que migran con menor intensidad hacia el polo positivo son las de circulo abierto (sólo tienen nick en una de las cadenas), ya que estas moléculas son mas laxas y presentan por ello mayor dificultad para atravesar la malla del gel.
Si se trata a la preparación con el plásmido con una enzima de restricción que tiene un sitio de corte se observa una sola banda, que corresponde a la banda (si se trata del mismo plásmido) de moléculas lineales del plásmido sin digerir, ya que la enzima de restricción(si se la deja el tiempo suficiente y en condiciones óptimas) rompe la doble cadena de todos los plásmidos, por lo que las moléculas quedarán lineales y no habrá superenrolladas o laxas..
Si al tratar una preparación de DNA plasmídico (del que no se conoce el mapa) con una enzima de restricción aparecen dos bandas no se puede asegurar que existan dos sitios de corte para esa enzima ya que puede cortar en un solo sitio y se puede cortar en otro sitio, generando otro fragmento, por acción mecánica al pipetear o al agitar la solución; también
puede ser la solución no estuviera completamente purificada y presentara otra enzima de restricción, dando como resultado en la corrida dos bandas diferentes.
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