AISLAMIENTO DE CÉLULAS MESENQUIMALES DE GRASA DE CERDO.
En la grasa se han encontrado otro tipo de células madre, las denominadas células mesenquimales, estas pueden diferenciarse en numerosos tipos de células, tienen una gran capacidad de autorrenovación y de regeneración de tejidos, además son células que no producen rechazo.
Las células madre mesenquimales pueden ser aisladas de lipoaspirados recogidos de varias regiones del cuerpo, incluyendo la cadera, muslo y las regiones del abdomen.
Para hacer el aislamiento de las células debemos tratar al cerdo con la mayor esterilidad posible para que la contaminación de nuestras células sea más difícil, para ello llevamos al cerdo a un quirófano, y con un bisturí estéril lo hacemos una incisión, retiramos con cuidado el tejido adiposo con pinzas y tijeras estériles, y tomamos la grasa.
Para que esta no se quede seca y se mueran las células la introducimos en un vaso con PBS (todo estéril, tanto el vaso como el PBS). Lo tapamos y lo introducimos en una campana de flujo laminar, para hacer la extracción de células sin que se contamine.
Y seguimos el siguiente protocolo:
1º Preparamos la collagenasa al 0,2%, la cantidad que preparemos de esta va a depender de la cantidad de grasa que tengamos, para prepararla necesitamos:
200 mg de collagenasa en polvo.
200 mg de CaCl2.
100 ml de PBS estéril.
La función del CaCl2 es ayudar a la acción de la collagenasa.
2º Para activar la collagenasa, la tenemos que poner a 37ºC durante una hora, pero no puede estar más de 2 horas.
3º Tomamos una placa de petri estéril y la pesamos en la balanza, luego, introducimos en la placa la grasa que tenemos de la extracción y la pesamos, esto se realiza para saber la cantidad de grasa que hemos extraído.
4º En esta misma placa de petri añadimos PBS estéril, y con la ayuda de las tijeras y de las pinzas comenzamos a lavar el trocito de grasa para quitarle la sangre que tiene, luego, lo que hacemos es ir troceando la grasa, en trocitos muy pequeñitos.
5º Cuando ya esté el trozo de grasa troceado, vamos recogiendo con una pipeta estéril los trocitos de grasa e introduciéndolos en otra placa de petri, para luego después añadir más PBS, debemos estar haciendo esto hasta que el PBS quede limpio.
6º Una vez limpio el PBS, tomamos un matraz Erlenmeyer estéril, y lo introducimos en la campana, tomamos los trocitos de grasa, intentando que tengan la menor cantidad posible de PBS, y calculamos los mililitros que tenemos de grasa.
7º Añadimos la misma cantidad en mililitros de collagenasa activada que tenemos de PBS, y lo introducimos a 37ºC y en agitación durante una hora, para que la collagenasa comience a romper las uniones de las células, si se observa que no está homogéneo se puede dejar más tiempo, pero, hay que tener cuidado, porque la collagenasa puede romper las células, ya que es una enzima proteolítica, que degrada el colágeno.
8º Pasada la hora, añadimos al Erlenmeyer, el mismo volumen de medio de cultivo que tenemos de grasa + PBS + collagenasa, para inactivarla. El medio de cultivo que se añade para inactivar la collagenasa lleva:
10% FBS.
1% Glutamina.
1% Penicilina/estreptomicina.
10 μl de Fungizona por cada ml de medio.
9º Repartimos todo el líquido que tenemos en el Erlenmeyer en tubos falcón de 50 ml, lo centrifugamos 10 minutos a 450 g. ( ).
10º Se desecha el sobrenadante y se deja el pellet. Se añade 1 ml de PBS a cada falcón para resuspender bien las células, se mezclan todas en el mismo falcón y se añaden hasta 30 ml de PBS en el falcon.
11º Se centrifugan 10 minutos a 450 g.
12º Se desecha el sobrenadante y se resuspenden en 10 ml del tampón de lisis de los eritrocitos. Este lleva:
155 mM de NH4Cl.
10mM de Tris-HCl.
Se ajusta el pH a 7,3 -7,5.
Se esteriliza por filtración.
Esta solución se encarga de romper los eritrocitos que hayan quedado con las células y que no hemos sido capaces de eliminar con el PBS, por eso el pellet tiene un tono marrón.
13º Se llevan las células con el tampón de lisis al agitador y las tenemos allí durante 10 minutos.
14º Se llena de PBS el falcon.
15º Se centrifuga 10 minutos a 450 g.
16º Se desecha el PBS, y se añaden 5 ml de PBS, se resuspende el pellet.
17º Se toma un filtro de 70 a 100 μm de nylon, también se puede hacer con una malla estéril, poniéndola sobre un falcon de 50 ml, también estéril y se comenzando a pasar las células por la malla despacito para que no se empape toda la malla y se queden en ella todas las células.
18º Añadir más PBS para lavarlas.
19º Centrifugar 10 minutos a 450 g.
20º Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de medio con FBS, amp/strep, glutamina y fungizona.
21º Tomamos 20 μl de las células y lo añadimos en un eppendorf con 20 μl de Trypan Blue para hacer el recuento.
22º Sembramos entre 160.000 y 200.000 células/cm2. Normalmente estas cantidades dan buenos resultados. Sembrarlas en un flask de 25.
23º A las cuatro horas o al día siguiente cambiar el medio a las células, ya que las células que nosotros queremos aislar se adhieren al plástico, las demás flotan. Solo 1 de cada 30 células es de las que nos interesan, y al realizar este cambio de medio, lo que conseguimos es desechar las células que no queremos y quitar todos los desechos del aislamiento.
24º Cambiar el medio cada 3-4 días.
25º Realizar el pase de las células cuando estas hayan llegado al 80% de confluencia.
PASES:
P0: se realiza a los 10 – 15 días, cuando las células estén confluentes. Sembrar a 1000 células/cm2.
P1 y siguientes: Se realizan cuando hayan llegando al 80% de confluencia. Debes estar en una fase de crecimiento logarítmica. Si llegan al 100% de confluencia comienzan a diferenciarse. Sembrar las células en una placa, a una concentración de 5000 células/cm2. (ratio 1:3).
Usar células de 2-5 pases.
