CONSERVACIÓN DE CÉLULAS CONGELADAS. CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN.

 

Es importante disponer de alícuotas congeladas de las células con el fin de minimizar la acumulación de cambios genéticos en las líneas continuas, evitar la senescencia y la transformación en las líneas finitas, y evitar la pérdida accidental de una línea por muerte o contaminación.

En la actualidad el mejor método de almacenamiento es la congelación en nitrógeno líquido. Las células crecidas hasta un 70-80% de confluencia (fase logarítmica del cultivo) se resuspenden. La suspensión celular, idealmente de alta concentración celular, debe ser congelada lentamente (descenso de aproximadamente 1ºC/min) en presencia de un agente preservante como el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO).

Las células son transferidas rápidamente a nitrógeno líquido (-196ºC) cuando alcanzan una temperatura inferior a -50ºC, esto se consigue introduciendo los tubos con las células en un recipiente especial con propanol, e introduciéndolo primero en el congelador de -80ºC.

Hasta llegar a -80ºC, la temperatura debe bajar lentamente para evitar la formación de cristales intracelulares que puedan dañar a las células.

En el nitrógeno líquido se  almacenan sumergidas o en la fase gaseosa superior durante largos periodos de tiempo (años) sin deterioro celular apreciable. El almacenamiento a temperaturas tan bajas como -80ºC es posible aunque se detecta deterioro de las células a las pocas semanas y/o meses. 

Las bajas temperaturas afectan la difusión y ósmosis a través de las membranas. El objetivo de la criopreservación es mantener la viabilidad y funcionalidad celular. Este se consigue porque el frio enlentece las reacciones enzimáticas que se producen dentro de las células.

Los periodos críticos para la sobrevida celular durante la criopreservación son la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a las condiciones fisiológicas normales, por ello la descongelación de los stocks se ha de realizar rápidamente, diluyendo la suspensión y eliminando el agente preservante con la máxima rapidez.

La membrana celular es la estructura que sufre mayor daño en la congelación, esto es debido a la pérdida de fluidez de los componetes lipídicos, dando un alto grado de fragilidad celular. La lesión celular crioinducida se explica en función de la formación de hielo intracelular y del estrés osmótico al que se ven inducidas durante la congelación.

Existen muchas soluciones de congelación de células. Se recomienda el uso de 10% DMSO en suero bovino fetal (FBS), aunque algunas líneas continuas se congelan con la misma eficacia en 10% DMSO en medio completo (usualmente DMEM 10% FCS). Otros tipos celulares como los hepatocitos se congelan bien en soluciones de sales de alginato.

 

Tipos de soluciones de congelación.

PERMEABLES O INTRACELULARES:

                De bajo peso melecular, Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1- propanodiol,  etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes; todos estos compuestos deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma.

                Es más usado es el DMSO, que es un solvente bipolar, hidrosoluble, de bajo peso molecular. Su acción se atribuye principalmente a la habilidad de prevenir la acumulación excesiva de electrolitos y otras sustancias durante el proceso de congelación, y la formación de cristales de hielo que rompen la estructura de la membrana, su bajo peso molecular permite la entrada rápida a través de la membrana celular.


IMPERMEABLES O EXTRACELULARES:

                De alto peso molecular efectivas a velocidades altas de congelación, son importantes     por ejercer su acción crioprotectora promoviendo la rápida deshidratación celular y suelen usarse asociadas a los agentes penetrantes.

                Son: glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa, rafinosa y  otros azucares, estos compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua.

 

Los crioprotectores evitan el daño celular:

                1º-  Inhibiendo la formación de cristales intracelulares.

                2º- Disminuyendo el gradiente osmótico.    

                3º- Aumentando la formación de cristales extracelulares,                         formando un caparazón.

 

 

CONGELACIÓN.

1º-  Tripsinización de los flask para levantar todas las células.

                -Quitamos el medio de cultivo del flask y lavamos tres veces con PBS, este debe estar atemperado a 37ºC.

                -Añadimos 2 ml de tripsina al 1X, es decir, al 0,05%, en el caso de los flask de 75 cm2 y  la dejamos actuar durante 5 minutos a 37ºC, esto dependerá del tipo de células con las que trabajemos.

                -Pasado este tiempo añadimos 2 ml de medio de cultivo para inactivar la tripsina (la misma proporción de medio que de tripsina), ya que esta puede matar a las células, ya que la tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces de las proteínas mediante hidrólisis para formar péptidos o  proteínas de menor tamaño.

                - Pipeteamos bien la mezcla, procurando levantar algunas células si no se han despegado del todo.

                -Tomamos la mezcla con una pipeta y la introducimos en un falcon para centrifugarla, la centrifugación se hará a 450G durante 5 minutos. Con esto conseguimos eliminar la tripsina y poder añadir a las células medio nuevo.

2º- Recuento de las células con azul tripán, para ello resuspendemos las células que antes hemos centrifugado en medio de cultivo, la resuspendemos bien, y tomamos 20 μl, a  los cuales los vamos a añadir otros 20 μl de azul tripán, los resuspendemos bien y procedemos a introducirlo en la cámara de neubauer.