TRIPSINIZACIÓN DE CÉLULAS.
La tripsina es una enzima que rompe los enlaces de las proteínas mediante hidrólisis. Es producida en el páncreas y activada en el duodeno.
En cultivos celulares de células adherentes se usa para despegar las células de la superficie de crecimiento (placas de cultivo) y poder tenerlas en suspensión.
Si tenemos las células mucho tiempo en tripsina, esta daña las células, para ello debemos inhibirla usando medio de cultivo, porque este contiene suero (FBS) que inhibe la acción de la tripsina.
PROTOCOLO.
Para flask de 75 cm 2.
1º Atemperar todos los reactivos, medio de cultivo, tripsina y PBS.
2º Una vez atemperado lavar el flask un par de veces con PBS.
3º Añadir 2 ml de tripsina e incubarlo a 37ºC durante 2-3 minutos, el tiempo de incubación variará dependiendo la línea celular.
4º Añadir el medio de cultivo para inhibir la tripsina.
5º Introducir las células en un falcon y lavar la placa de cultivo con PBS y añadirlo en el falcon.
6º Centrifugar 5 minutos a 450 g, o 1500 rpm.
7º Resuspender en medio de cultivo y contar en la cámara de Neubauer, la cantidad en la resuspendemos las células dependerá de la cantidad de células que creamos que tenemos.
8º Tomamos 20 μl de la suspensión de células y lo mezclamos con 20 μl de trypan blue.
9º Contamos las células en la cámara de Neubauer, las células que estén teñidas de azul no se cuentan porque están muertas, ya que el trypan blue, es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen de color azul, son consideradas no viables, y estas no se cuentan.
10º Calcular las células que tenemos con la siguiente fórmula:
nº cel contadas
------------------------------ X 2 X 10000
nº cuadros contados
Esta fórmula, nos dá el número de células por mililitro.
11º Para hacer un nuevo cultivo de las células que hemos contado, calculamos con una regla de tres, las células que queremos sembrar.
